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技術支持

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什么是PCR實驗室及設計原則

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一、 什么是PCR實驗室

PCR 是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。聚合酶鏈式反應也可以 當作一項極其重要的酶促合成 DNA 技術。PCR 又稱為無細胞克隆系統或特異性 DNA 序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新,它可將極微量的靶 DNA 特異地擴增上百萬倍。聚合酶鏈反應(PCR)是在 DNA 聚合酶催化下,以母鏈 DNA 為模板以特定引物為延伸起點,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板 DNA 互補的子鏈 DNA 的過程。是 一項 DNA體外合成放大技術,能快速特異地在體外擴增任何目的 DNA??捎糜诨蚍蛛x克隆,序列分析,基因表達調控,基因多態性研究等許多方面。一對合成 DNA 的引物經過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環,每一次循環使特異區段的基因拷貝數放大一倍,一般樣品是經過 30 次循環,最終使基因放大了數百萬倍; 將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區段的 DNA 帶。

二、PCR實驗室設計原則(以非洲豬瘟檢測PCR實驗室為例):

1、非洲豬瘟檢測實驗室的選址:

   符合國家檢測實驗室的相關規定,具體適用于屠宰場來說,可選擇辦公樓或者獨立的實驗室空間,選址絕對不能和屠宰線相通,如果實驗室陽性對照污染,會污染整個屠宰生產線,勢必對屠宰場造成巨大的經濟損失。

   個別不專業的實驗室設計建造公司因為不了解非洲豬瘟檢測實驗室的檢測流程,造成設計布局不合理,對后期開展工作造成很大的不便及生物安全隱患。

2、主體結構:

   目前實驗室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金R50內角鋁,從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。并且彩鋼板結構牢固,線條簡明,美觀大方,密封性好。

3、標準的四區分隔和氣壓調節:

   PCR 過程分成試劑準備、標本制備和 PCR 擴增區及產物分析檢測區四個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區,同時各區通過氣壓調節, 使整個 PCR 實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。

另外:

   PCR 實驗室根據使用儀器的功能合理設置各個工作區域,如采用聚合酶聯反應:則設置試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區四個單獨的工作區域,這是最常用的分區方式。樣品需要粉碎處理的,還需增設樣品粉碎區;若使用實時熒光 PCR 法:基因擴增區、基因產物分析區可以合并在一個房間內;采用標本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的全自動化 PCR 分析儀,則標本制備區、擴增區、擴增產物分析區可合并為一個區域,因此 PCR 實驗室原則上設置五個區或四個區或三個區或二個單獨的工作區。

  核酸擴增前區和核酸擴增后區可設在一個房間內,但必須在滿足下列要求的前提下:

a. 核酸擴增前區實驗室內設置兩個不同位置的實驗區,試劑配置在超凈工作臺中操作,樣品處理在生物安全柜內操作。

b. 在核酸擴增后區使用全封閉的擴增和檢測系統,如實時熒光 PCR 儀等。

c. 每個實驗人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

d. 在實驗前后對操作區域和共享器具進行清潔及消毒。

e. 各區域的試劑、器具、儀器和設備為該區專用,不得交叉使用。

4、非洲豬瘟檢測實驗室的布局:

非洲豬瘟檢測實驗室用的儀器為熒光定量PCR,因此核酸擴增和分析在一個區,實驗室設計需要如下功能房間:PCR緩存走廊、帶緩存間的配液室、帶緩存間的樣品處理室、帶緩存間的核酸擴增分析區及實驗室用具消毒室。

5、非洲豬瘟檢測實驗室生物安全保護:

理論上講非洲豬瘟檢測實驗室是BSL-2 生物安全實驗室,需要配置二級生物安全柜,推薦選擇70%外排,30%內循環,各功能房間緩存設置更衣柜和消毒器,各區的實驗服專用,物料流通需要配置帶紫外線的互鎖的傳遞窗,實行人流物流分開設置。

6、非洲豬瘟檢測實驗室消毒:

在三個實驗區和三個緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈,供消毒用。

在試劑準備區和標本制備區還設置移動紫外線燈,對實驗桌進行局部消毒。

7、非洲豬瘟檢測實驗室機械連鎖不銹鋼傳遞窗:

試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞,保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染(人物分流)。

8、非洲豬瘟檢測實驗室地面

地面建議使用 PVC 卷材地面或自流坪地面,整體性好。便于進行清掃,耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面,或大塊的瓷磚(至少 800mm×800mm)接縫需要小于 2mm。

9、非洲豬瘟檢測實驗室照明

燈具要選用凈化燈具,能達到便于清洗、不積塵的特點。

三、空氣流與壓差要求

PCR 實驗室的空氣流向必須嚴格按照試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區空氣壓力逐漸遞減方式進行,防止擴增產物順空氣氣流進入擴增前的區域。風速流向不得混亂。

為了保證房間內的壓差和避免污染,應在空調面板處寫清楚送風機和排風機的開啟順序和關閉順序,先后順序不得混亂。

空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間的靜壓差應大于 5 帕,潔凈室()與室外大氣的靜壓差應大于 10 帕,應配備監測靜壓差的設備,并定期監控。

一般情況下,試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓,以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入,造成污染;可以通過控制進風風量大于排風風量達到正壓效果。

核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓,以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品,可以通過控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。

在理想情況下,PCR 實驗室緩沖間內,可設置正壓,使室內空氣不流向室外,室外空氣不流向室內。PCR實驗室進風由原有中央空調控制的要求將中央空調風口安裝到指定定點。

四、實驗室設施要求:

實驗室基礎設施設計:包括實驗室基礎裝修、實驗室凈化工程、實驗室供排水工程、實驗室電路系統。

1)實驗室基礎裝修需要潔凈天花、地板、隔斷,合理設置緩存間及配置凈化門、觀察窗、傳遞窗等。

2)實驗室凈化工程 實驗室應配備單獨送排風設施,試劑配置區、核酸提取區和擴增分析區應配備凈化系統。

3)實驗室供排水工程包括非手動水龍頭、不銹鋼或PP水池和緊急淋浴器及供排水管線管路。

4)實驗室電路系統:根據儀器的功率配置合適的功率,特別注意高壓滅菌鍋的功率,注意實驗室用電安全。

5)配備適用的應急器材,如應急照明設備、消防器材、意外事故處理器材等。

五、實驗室儀器及設備

1)更衣室儀器及設備:更衣柜或掛衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。

2)配液室儀器及設備:國鉉超凈工作臺、冰箱、小型離心機、旋渦振蕩器、微量移液器等。

3)樣品處理室儀器及設備:離心機、組織研磨機、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、冰柜等、可移動紫外消毒器。

4)核酸提取室儀器及設備:核酸提取儀、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、小型離心機、微量移液器、可移動紫外消毒器等。

5)擴增分析區儀器及設備:熒光定量PCR儀、電腦、打印機、不間斷電源、可移動紫外消毒器等。

6)消毒洗滌室:高壓滅菌器、干燥箱、器皿柜等。

 

六、實驗室面積及設備間距

一般來說各房間的面積沒有嚴格要求,只需能放置所需儀器設備,并且便于人員操作即可,但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米,并且每增加一臺生物安全柜,房間就要增加 10 平米。各實驗室緩沖間的面積一般為 1300*1300 1500mm 為宜,并且緩沖間的面積不能 大于實驗室房間面積的 1/8。

在做平面設計的時候,首先要考慮的因素是就是“安全”,實驗室是最易發生爆炸、火災、毒氣泄露等的場所。我們在做平面設計的時候,應盡量地要保持實驗室的通風流暢、逃生通道暢通。根據國際人體工程學的標準。

我們做如下的劃分以供參照:

實驗臺與實驗臺通道劃分標準(通道間隔用 L 表示)

L>500mm 時,一邊可站人操作;

L>800mm 時,一邊可坐人操作;

L>1200mm 時,一邊可坐人,一邊可站人,中間不可過人;

L>1500mm 時,兩邊可坐人,中間可過人;

L>1800mm 時,兩邊可坐人,中間可過人可過儀器

天平臺、儀器臺不宜離墻太近,離墻 400mm 為宜。為了在工作發生危險時易于疏散,實驗臺間的過道應全部通向走廊。另:實驗室建筑層高宜為 3.7 -4.0 米為宜,凈高宜為2.7-2.8 米,有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實驗室凈高宜為 2.5 -2.7 米(不包括吊頂);實驗室走廊凈寬宜為 2.5 -3.0 .普通實驗室雙門寬以 1.1 -1.5 (不對稱對開門)為宜,單門寬以 0.8 -0.9 米為宜。

七、潔凈裝修要求

潔凈室(區)的內表面應平整光滑、無裂縫、接口嚴密、無顆粒物脫落,并能耐受清洗

和消毒,墻壁與地面的交界處宜成弧形或采取其他措施,以減少灰塵積聚和便于清潔。

潔凈室()內各種管道、燈具、風口以及其他公用設施,在設計和安裝時應考慮使用中

避免出現不易清潔的部位。

潔凈室()的窗戶、天棚及進入室內的管道、風口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應

密封。

八、人流路徑與物流路徑

進入實驗室區域工作人員應該按照以下路徑:

公共清潔區——更衣間(更換潔凈服)——緩沖間——污染實驗區

工作人員退出實驗室的路徑為:

污染試驗區——緩沖間——淋浴間(有條件的可設置)——更衣間——公共清潔區

所有的物品進入實驗區必須經過雙扉互鎖傳遞窗,利用傳遞窗消毒后才可進入,實驗室

內所有物品的也必須經過傳遞窗才可以傳遞到實驗室以外的清潔公共區。

門的開啟方向

實驗室建筑層高宜為 3.7 -4.0 米為宜,PCR 實驗室凈高宜為 2.5 -2.7 米(不包括吊頂);實驗室走廊凈寬宜為 2.5 -3.0 .普通實驗室雙門寬以 1.1 -1.5 (不對稱對開門)為宜,單門寬以 0.8 -0.9 米為宜。

一般實驗室門主要向里開,但如有危險的房間,房門應朝外開,房門材質最好選擇壓力

玻璃。

有壓差梯度的房間,門的開啟方向應朝向正壓方向一側開啟;

考慮到消防安全,對于那些主要逃生門的開啟方向應朝向清潔區方向開啟。

九、工作服要求

在凈化車間內工作的人員應穿著符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應與生產操作和空氣潔凈度級別要求相適應,并不得混用。潔凈工作服的質地應光滑、不產生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質。無菌工作服必須包蓋全部毛發、胡須及腳部,并能阻留人體脫落物。不同空氣潔凈度級別使用的工作服應當分別清洗、整理,必要時消毒或滅菌。工作服洗滌、滅菌時不應帶入附加的顆粒物質。工作服應制定清洗周期。

進入各個區域必須嚴格按照單一方向進行,不同的工作區域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開時,不得將工作服帶出。

實驗室應建立、執行人員進出潔凈區的清潔程序和管理制度,人員清潔程序合理。

十、人員培訓

配備至少兩名專業實驗員,能夠獨立處理樣品、提取核酸及核酸擴增,熟練掌握超凈工作臺、生物安全柜、自動提取儀、實時熒光定量PCR的使用,加強生物安全方面的培訓,避免實驗室污染。

 

 

附:非洲豬瘟檢測實驗室要求參考

一、非洲豬瘟

   非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病,臨床上以高熱、網狀內皮系統出血和高死亡率為特征,易感豬群的病死率高達100%。世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病,我國將其列為一類動物疫病。目前,針對非洲豬瘟防控,尚無有效的商品化疫苗,防控重點是做好生物安全管理和早期診斷撲殺凈化。

二、非洲豬瘟感染規律

   源于:《FAO動物生產與衛生手冊——非洲豬瘟:發現與診斷》

   ASF自然感染潛伏期為4-19天。

   最急性和急性感染通常在4-10天死亡。

   在臨床癥狀出現的2天前,ASF感染動物開始散播大量病毒。

   感染后7-9天血清轉陽,抗體持續很長時間,可持續終生。

三、非洲豬瘟檢測實驗室設備儀器配置方案

   用于非洲豬瘟病毒檢測的實驗室,推薦配置以下設備:II級生物安全柜、混勻儀(渦旋振蕩器)、高速離心機、金屬浴或恒溫水浴鍋、組織破碎儀(均質器/勻漿儀)、移液器、冷藏冷凍冰箱、高壓滅菌鍋。同時,建議實驗室配備合適的個人防護用品,如防護服、手套、口罩等。

    1. II級生物安全柜:提供無菌環境用于處理組織樣品等(避免外部環境污染樣品),同時保證病毒不向實驗室環境擴散(保證人員和環境安全)。

    2.高速離心機:用于血清的分離和樣品的處理的分離。

    3. 金屬浴或恒溫水浴鍋:提供恒溫環境,用于樣品處理過程中的裂解過程。建議選擇帶有震蕩功能的設備,或者配備單獨的混勻儀(渦旋振蕩器)。

    4.組織破碎儀(均質器/勻漿儀):根據樣品類型選擇便攜式組織破碎儀或者高通量組織破碎儀等(在用組織檢測時使用)。

    5. 移液器:用于實驗過程中的微量體積加樣。

    6.冷藏冷凍冰箱:用于樣品、試劑盒試紙等儲存,建議定期監測冰箱溫度。

    7.高壓滅菌器:用于實驗結束后樣品及用具的滅菌處理,避免樣品帶有病毒時泄露導致疫情擴散。


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